Ein System zur Unterdrückung der Genaktivität, das auf dem Cas13-Protein und der Leit-RNA basiert, arbeitet bei der chemischen Modifizierung von RNA-Nukleotiden um bis zu 80 Prozent effizienter, so amerikanische Wissenschaftler in einer in der Fachzeitschrift Cell veröffentlichten Studie. Eine Steigerung der Effizienz und Lebensdauer des Moleküls in der Zelle wurde durch Methylierung, Schwefeladdition oder inverses Thymidin am 3'-Ende der Leit-RNA gezeigt. Die modifizierten RNAs wurden auch in der SARS-CoV-2-Genregion und in primären menschlichen T-Lymphozyten getestet, wo sie sich ebenfalls als wirksam erwiesen.
In kurzer Zeit ist das Genom-Editing-System CRISPR / Cas zu einem festen Bestandteil vieler biologischer und medizinischer Forschungen geworden (wir haben mehr darüber im Material „Erinnere dich an diese Briefe“) geschrieben. Die Forscher Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna erhielten 2020 sogar den Nobelpreis für ihre Entdeckung dieses Mechanismus im Immunsystem von Bakterien. Der Hauptvorteil von CRISPR / Cas besteht darin, dass Sie mit dem System eine Lücke in einer bestimmten Region des Genoms machen und dann neue Sequenzen darin einfügen oder alte ausknocken können. Möglich wird dieser Mechanismus durch zwei Komponenten des Systems: eine kurze Leit-RNA, die das System zu einer bestimmten Region der Zell-DNA „führt“und das Cas9-Protein, das eine Lücke in die Region einfügt.
Aber gezielte DNA-Brüche sind nicht das einzige Ziel der Gentechniker. Oftmals müssen Wissenschaftler die Sequenz eines Gens nicht nur dauerhaft unterbrechen, indem sie es brechen, sondern seine Arbeit auch nur vorübergehend unterdrücken. Dazu werden Systeme auf Basis des CRISPR/Cas-Systems geschaffen, die in der Lage sind, spezifische mRNA-Moleküle – die Produkte von Genen – zu detektieren und zu unterdrücken. Somit ist ein weiteres Protein der bakteriellen Immunität, Cas13, in der Lage, gezielte Brüche in der mRNA einzuführen und so zu ihrem Abbau beizutragen. An der Entwicklung eines Systems basierend auf einer der Cas13-Formen, C2c2, waren russische Biologen unter der Leitung von Konstantin Severinov beteiligt, der N+1 in einem Interview von dieser Entdeckung berichtete.
Vorerst kann ein solches System des „Abschaltens“von Genen jedoch nur für kurze Zeit funktionieren. Der Punkt ist, dass die Leit-RNA CRISPR/Cas13 unter dem Einfluss des zellulären Abwehrsystems gegen freie Nukleinsäuren mit der Zeit abgebaut wird. Nukleaseenzyme bauen solche Moleküle ab, um sie vor Viren oder anderen Krankheitserregern zu schützen.
Wissenschaftler des New York City Genome Center unter der Leitung von Alejandro Mendez-Mancilla haben versucht, das Leit-RNA-System CRISPR / Cas13 zu stabilisieren. Dazu verwendeten sie vier Arten chemischer Modifikationen ihrer Nukleotide: die Einführung von Schwefel, Methyl oder beiden Gruppen in drei Uracile am Ende der RNA sowie die Zugabe von invertiertem Thymidin am Ende. Alle verwendeten Modifikationen haben ihre Wirksamkeit bei der Stabilisierung von RNA in der Zelle bereits bewiesen.
Die modifizierten Sequenzen wurden an den Genen von Zelloberflächenrezeptoren getestet: CD46, CD55, CD71. Guide-RNA wurde in den Kern einer transgenen menschlichen Zelllinie eingeführt, die Cas13d exprimierte. Drei Tage später wurde der mRNA-Spiegel der Rezeptorgene in den Zellen mittels Durchflusszytometrie überprüft. Bei gewöhnlicher unmodifizierter mRNA war der Effekt fast nicht wahrnehmbar – es gab noch viele mRNA-Rezeptoren in den Zellen. Jede der Modifikationen zeigte jedoch eine Steigerung der Effizienz der Gensuppression (p < 0,0001). Die Leit-RNA mit methylierten Uracilen funktionierte am besten und entfernte bis zu 80 Prozent der CD71-mRNA. Die Wirkung dieser Modifikation war jedoch von Gen zu Gen nicht so stabil. Die Zugabe von invertiertem Thymidin erwies sich als stabiler – etwa 55 Prozent für alle Gene.
Die Ergebnisse der Unterdrückung der Arbeit von drei Genen von Oberflächenrezeptoren für vier Arten der Modifikation von Leit-RNAs und Kontrollen
Biologen haben auch versucht, andere Nukleotide in der Leit-RNA zu modifizieren, aber dies brachte keine Ergebnisse, da offenbar die Wechselwirkung des Komplexes mit der mRNA gestört wurde. Das Testen anderer Nukleotid-Modifikationen hat jedoch gezeigt, dass die Addition von Phosphorothioat-Nukleotiden an das Ende des Moleküls ebenfalls wirksam ist. Die Forscher glauben, dass die Modifikationen an den Nukleotiden die RNA vor den Auswirkungen von Exonukleasen bewahren.
Die modifizierten RNAs wurden auf ihre Wirksamkeit in therapeutischen Anwendungen getestet – Biologen haben eine künstliche RNA basierend auf der RNA-Sequenz des SARS-CoV-2-Coronavirus entwickelt und versucht, diese mit einem neuen Ansatz zu zerstören. Die Leit-RNA mit Phosphorothioaten am Ende zeigte eine Verringerung der Menge an "viraler" RNA um etwa 70 Prozent.
Ein weiteres wichtiges Problem bei der Arbeit mit CRISPR-Systemen ist der Proteintransport in Zellen, die nicht so einfach genetisch modifiziert werden können und in sie das Cas13-Gen einfügen (wie die Zellen in den beschriebenen Experimenten). Biologen testeten die modifizierten RNAs beim Zusammenbau des RNA-Protein-Komplexes, bevor sie in Zellen eingebracht wurden. Zunächst wählten die Biologen die Bedingungen (Temperatur, Puffer, Proteinmenge und das Vorhandensein eines nuklearen Lokalisierungssignals darin) für einen effizienten Aufbau und Transport des Komplexes aus. Anschließend isolierten sie primäre T-Lymphozyten von gesunden Spendern zum Testen. Für die untersuchten CD4 + - und CD8 + -Populationen von Lymphozyten wurde eine Abnahme der Expression des Zielgens um 60-65 Prozent nach Verwendung der modifizierten Leit-RNA beobachtet.
Auf Basis von CRISPR / Cas9 werden immer mehr neue gentechnische Werkzeuge geschaffen. Zum Beispiel haben Forscher kürzlich herausgefunden, wie man ein Epigenom editiert – eine Sammlung von DNA-Methyl-Tags. Das CRISPRoff-System ist auch in der Lage, die Genaktivität zu unterdrücken, aber es tut dies, indem es Gene methyliert, wodurch sie weniger wahrscheinlich Transkriptionsenzyme bekommen.
