Von links nach rechts: "bearbeitete" schwarze Maus, gelbe Maus mit Phenylketonurie, Wildtyp-Maus
Die Forscher konnten eine Punktmutation korrigieren, die bei erwachsenen Mäusen zur Entwicklung von Phenylketonurie in der DNA von Leberzellen führte, wodurch die Mäuse geheilt wurden. Dazu modifizierten die Wissenschaftler den auf dem Cas9-Protein basierenden „Base Editor“so, dass sein Gen mithilfe eines viralen Vektors in die Leber transportiert werden konnte. Wie von den Autoren der Veröffentlichung in Nature Medicine vorgeschlagen, kann dieser Ansatz zur Behandlung einer Vielzahl von Erbkrankheiten bei Erwachsenen verwendet werden.
Das Genome Editing System CRISPR-Cas9 wurde wiederholt zur Behandlung von Erbkrankheiten im Tiermodell getestet. Das Prinzip der Editierung mit der "klassischen" Version von Cas9 beruht jedoch darauf, dass das Protein einen Schnitt macht, der dann unter Beteiligung des homologen DNA-Rekombinationssystems geheilt wird. Dieses System ist bei der Zellteilung aktiv, aber viele Gewebe und Organe des erwachsenen Körpers enthalten überwiegend ruhende Zellen, bei denen die CRISPR-Bearbeitung nicht gut funktioniert. Dazu gehören insbesondere Leberzellen, und ein Mangel an Leberenzymen durch Punktmutationen liegt einer ganzen Gruppe von Erbkrankheiten zugrunde.
Um Mutationen in Zellen mit hoher Effizienz zu korrigieren, ist es möglich, dort sogenannte "Base-Editoren" auf Basis einer inaktiven Nuklease (zB dCas9) zu liefern, die an DNA bindet, diese aber nicht schneidet. Die Editierfunktionen werden hier von Deaminase-Enzymen ausgeführt, die an die Nuklease "angenäht" sind (mehr über die Funktionsweise der "Base-Editoren" können Sie hier und hier lesen). „Redakteure“können beispielsweise „Buchstaben“GC in TA ändern und umgekehrt ohne Kürzungen. Solche Fusionsproteine sind jedoch sehr groß und ihr therapeutischer Nutzen wird durch die Möglichkeiten begrenzt, DNA (genauer die sie kodierenden Gene) in das Gewebe einzubringen. Die beliebtesten Vektoren für die Übertragung beispielsweise in die Leber bleiben Adeno-assoziierte Viren, aber ihre "Kapazität" ist eher gering.
In der neuen Arbeit haben Wissenschaftler der Technischen Hochschule Zürich mit einem Baseneditor eine Mutation im PAH-Gen korrigiert, die in der Leber erwachsener Mäuse zu Phenylketonurie führt. Phenylketonurie wird durch einen Mangel des Leberenzyms Phenylalanin-Hydroxylase (PAH) verursacht, das die Umwandlung von Phenylalanin in Tyrosin katalysiert. Als Folge der Akkumulation von Phenylalanin treten bei Patienten eine Reihe von neurologischen Symptomen auf, einschließlich geistiger Behinderung und Krampfanfällen. Eine Mutation im Maus-PAH-Gen, die zur Substitution von C durch T an Position 835 führt, führt auch zur Entwicklung ähnlicher Symptome bei Mäusen, daher gelten solche Mäuse als gutes Modell für die Untersuchung der Phenylketonurie. Darüber hinaus ist die Erholung der Enzymaktivität bei Mäusen leicht zu verfolgen, da kranke Tiere einen Melaninmangel haben, wodurch sie nicht schwarz, sondern gelb sind.
Um das riesige genetische Konstrukt, das den "Editor" kodiert, in die Leber zu bringen, mussten die Wissenschaftler das Protein in zwei Teile aufspalten und jeweils ein halbes Stück Intein-Sequenz hinzufügen, die für das "Protein-Spleißen" verantwortlich ist. Wenn die Hälften verschmelzen, wird die Inteinsequenz wiederhergestellt und gespalten, wodurch die Teile des "Editors" zu einem ganzen Protein zusammengefügt werden. Das eine separate Hälfte codierende Konstrukt wurde in einen separaten viralen Vektor verpackt, der es an die Leber liefern sollte.
Obwohl eine solch komplexe Anordnung eine signifikant reduzierte Bearbeitungseffizienz aufweisen sollte, zeigte das Zellexperiment eine vergleichbare Bearbeitungseffizienz. Darüber hinaus sank bei Mäusen, denen eine hohe Dosis viraler Partikel injiziert wurde, nach sechs Wochen die Konzentration von Phenylalanin im Blut um das 20-Fache auf einen physiologischen Wert von weniger als 120 Mikromolar. Die Effizienz der DNA-Editierung in Leberzellen betrug durchschnittlich 10 Prozent vier Wochen nach Einschleppung der Viren und 25 Prozent nach 26 Wochen, der Effizienzwert der mRNA-Sequenz lag sogar bei 63 Prozent. Gleichzeitig erholte sich die Enzymaktivität innerhalb von 2-23 Prozent der Norm und der "gesunde" schwarze Phänotyp wurde bei Mäusen wiederhergestellt. Die Autoren der Arbeit kamen zu dem Schluss, dass "Base Editoren" in dieser Form gut geeignet sind, Mutationen in Zellen mit begrenztem Teilungspotential zu korrigieren.
Letztes Jahr haben wir über einen Versuch gesprochen, DNA in adulten Leberzellen mit Zinkfinger-Nukleasen zu bearbeiten. Als Teil der Viruspartikel war geplant, bei mehreren Patienten mit Hunter-Syndrom sowohl Nuklease als auch eine normale Kopie des Gens an die Leber zu liefern, die in die Schnittstelle eingebracht werden sollte. Ein kürzlich veröffentlichter vorläufiger Bericht hat gezeigt, dass die Wirksamkeit dieses Ansatzes gering ist.
