Struktur des Cas9-Nuklease-Komplexes mit Leit-RNA
Ein internationales Team von Wissenschaftlern aus Russland und den USA hat ein Enzym entdeckt, das in der Lage ist, mithilfe eines RNA-Guides gezielt die gewünschte RNA zu zerstören. Nuklease ist eine der Varianten des CRISPR-Systems, wirkt jedoch im Gegensatz zum weithin bekannten CRISPR / Cas9 auf RNA-Ebene, nicht auf DNA, wodurch das Risiko einer Genomdestabilisierung durch das Einführen von „falschen“Brüchen eliminiert wird. Die Arbeit wurde noch nicht begutachtet und ist als Preprint in der Datenbank bioarXiv.org verfügbar.
Das 2012 erstellte Genome Editing System CRISPR / Cas9 basiert auf dem bakteriellen antiviralen Immunsystem. Diese Immunität ermöglicht es Bakterien, Fragmente der Virus-DNA in ihrem CRISPR-"Kartenindex" (in einem bestimmten Teil des Bakteriengenoms) zu finden und virale DNA mit einer speziellen Nuklease zu zerstören.
Verschiedene Bakterien und Archaeen haben mehrere Arten von CRISPR-Systemen und mehrere Nukleasen, jedoch wird die Cas9-Nuklease fast immer für die Genom-Editierung in der Biotechnik verwendet (dies spiegelt sich im Namen der Methode wider). Der Hauptvorteil dieser speziellen Nuklease besteht darin, dass Cas9 unabhängig arbeitet (es ist ein Protein), während die meisten anderen CRISPR-Nukleasen in einem Komplex aus mehreren Enzymen arbeiten, und die Verwendung von Komplexen mit mehreren Untereinheiten für die Genom-Editierung unpraktisch und oft ineffektiv ist.
Das CRISPR/Cas9-System hat drei entscheidende Nachteile. Erstens ist die Cas9-Nuklease ein ziemlich großes Protein, dessen Gen oft nicht in Träger (Vektoren) passt, die verwendet werden, um genetische Konstrukte in Zellen einzuführen.
Zweitens wirkt Cas9 nur auf DNA, nicht auf RNA. Dies kann nicht als Nachteil bezeichnet werden, wenn wir wirklich das Genom der Zelle bearbeiten, also ihre DNA verändern wollen. Oftmals lässt sich das gewünschte Ergebnis jedoch einfach dadurch erzielen, dass man die Aktivität des gewünschten Gens auf RNA-Ebene „ausschaltet“– indem man einfach alle Kopien dieses Gens zerstört. Ein solcher Eingriff, bekannt am Beispiel der RNA-Interferenz, ist potentiell sicherer, da er keine Instabilität in das Genom einbringt. Selbst wenn sich beispielsweise die Nuklease bei der Wahl des Targets irrt, führt dies in keiner Weise zum Auftreten von Mutationen im Genom. Eine solche Methode könnte möglicherweise näher an therapeutischen Anwendungen sein als echtes Genome Editing mit CRISPR / Cas9.
Drittens ist die Genome-Editing-Methode CRISPR/Cas9 derzeit Gegenstand eines Patentstreits, der ihren Einzug in die klinische Praxis erheblich verzögern könnte. All diese Gründe erfordern die Suche nach neuen Nukleasen, die verwendet werden könnten, um die Genaktivität zu regulieren.
Zuvor gelang es derselben Gruppe von Forschern, ein bioinformatisches System zur Suche nach neuen Arten von CRISPR-Immunität in den Genomdaten von Bakterien zu schaffen und eine neue Klasse von CRISPR-Systemen zu finden, einschließlich der hypothetischen C2c2-Nuklease. Dies ist ein kleines Protein, das, wie eine Sequenzanalyse zeigt, höchstwahrscheinlich nicht auf DNA, sondern auf RNA wirkt.
In der neuen Arbeit konnten die Wissenschaftler diese Annahmen bestätigen und das neue CRISPR/C2c2-System in Aktion testen. Dazu übertrugen die Autoren die Sequenzen von CRISPR, C2c2 und anderen Komponenten des Systems aus Leptotrichia (Leptotrichia shahii), in deren Genom sie gefunden wurde, in das Genom von Escherichia coli. Anschließend infizierten die Wissenschaftler die Bakterien mit dem MS2-RNA-Virus und betrachteten die überlebenden Zellen. So war es möglich, die Fragmente des Virus zu erkennen, die für die Wirkung von CRISPR/C2c2 am anfälligsten sind, und die Substratpräferenzen des C2c2-Enzyms zu bestimmen.
Als Test der biotechnologischen Eigenschaften des CRISPR/C2c2-Systems lernten die Autoren, das rote Leuchten von Bakterien auszuschalten, indem sie die RNA des zuvor in die Zellen eingebrachten Gens des rot fluoreszierenden Proteins zerstörten. Die Abschalteffizienz lag den Wissenschaftlern zufolge zwischen 20 und 92 Prozent, je nach gewähltem Target auf der RNA des fluoreszierenden Proteins.
Diese Effizienz ist vergleichbar mit der Effizienz der RNA-Interferenz, die ähnlich funktioniert, jedoch auf Kosten anderer molekularbiologischer Mechanismen. RNA-Interferenz hat ihre eigenen Nachteile. Beispielsweise werden kurze RNAs, die zum Abschalten von Genen in Zellen eingebracht werden, durch unspezifische RNasen sehr schnell zerstört und können oft nicht in die Zelle gelangen, weshalb die therapeutische Wirksamkeit deutlich reduziert wird.
Alexander Ershov
