Biologen haben das CRISPRoff-System entwickelt, das in der Lage ist, die Genaktivität gezielt zu unterdrücken, ohne Mutationen in die DNA einzuführen. Der Mechanismus dieses Werkzeugs basiert auf epigenetischer Reprogrammierung, die unabhängig von CpG-Methylierungsstellen in Genen ist. Die Unterdrückung der CRISPRoff-Genaktivität wird vererbt, was in Generationen von Stammzellen gezeigt wurde, die sich zu Neuronen entwickeln. Wissenschaftler haben auch ein Werkzeug entwickelt, das die Genaktivität nach CRISPRoff wiederherstellen kann, und es CRISPRon genannt. Die Forschung wird in der Zeitschrift Cell veröffentlicht.
Von der Redaktion
Anfangs hieß der Hinweis "CRISPR-Tool bearbeitet das Genom ohne DNA-Brüche", aber zuvor gab es bereits Systeme, die auf "totem" Cas9 (totes Cas9) basierten und in der Lage waren, Veränderungen im Epigenom vorzunehmen. Aber in solchen Arbeiten wurde im Gegensatz zu der in der Anmerkung diskutierten die Vererbung von Veränderungen in den Generationen von sich teilenden Zellen nicht überprüft, was sich im überarbeiteten Titel widerspiegelt. Das gerichtete genomische Editiersystem CRISPR / Cas9 ist eines der gefragtesten Werkzeuge in der biologischen Forschung. Ein solches System ermöglicht es, mit dem Cas9-Protein in Kombination mit einer Leit-RNA, die am häufigsten für zwei Zwecke verwendet wird, an einer bestimmten Stelle im Genom Brüche zu machen: "Ausschalten" eines defekten Gens oder Einfügen einer neuen Sequenz in die brechen. Die Gewinnung von Modellen mit nicht funktionierenden Genen ermöglicht es, deren Funktionen zu studieren und die Eigenschaften von Organismen je nach Aufgabenstellung der Wissenschaftler zu verändern. Für die Entdeckung der Wirkmechanismen des CRISPR/Cas-Systems im Jahr 2020 wurde der Nobelpreis an die Forscher Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudne verliehen.
Trotz der Vielseitigkeit dieser Methode ist ihre Anwendung durch die Notwendigkeit, Brüche in der DNA-Sequenz zu machen, begrenzt, was oft zu Mutationen in Nicht-Zielregionen des Genoms und fehlerhafter DNA-Reparatur in den Zielregionen führt. Zum Beispiel konnte der berüchtigte He Jiangkui, der zuerst gentechnisch veränderte Kinder (und anschließend eine Gefängnisstrafe) erhielt, die Genauigkeit von CRISPR in seinen Experimenten nicht kontrollieren - es gab ungezielte Mutationen im Genom der Zwillinge.
Biologen der University of California haben einen CRISPR-Mechanismus entwickelt, der Gene ausschalten kann, ohne Brüche und Mutationen in die DNA einzuführen. Es basiert auf epigenetischer Reprogrammierung - Methylierung von Nukleotiden (Anheftung einer Methylgruppe an sie), so dass das Gen seine Affinität zu Transkriptionsenzymen verliert und aufhört zu arbeiten. Biologen nannten ihre Entwicklung CRISPRoff.
Wie im klassischen CRISPR-Tool ist eine der Komponenten darin das Cas9-Protein, jedoch nicht gewöhnlich, sondern "tot" (deadCas) - d.h. es kann nur an die gewünschte DNA-Region binden, aber keine Unterbrechung darin machen. Hinzu kamen andere katalytische Domänen - Methyltransferrasen. Somit war das chimäre Protein in der Lage, DNA-Nukleotide um sich selbst herum zu methylieren, wodurch die Aktivität von Genen unterdrückt wurde. Gleichzeitig war es bereits 10 Tage nach Zugabe des Proteins zu den Zellen nicht mehr nachweisbar, obwohl seine Wirkung bis zu 15 Monate Studienzeit anhielt. Die Spezifität und Effizienz des Systems wurde durch RNA-Sequenzierung bestätigt – die supprimierten Gene hatten praktisch keine Transkripte. Der CRISPRoff-Effekt wurde auch bei Genen beobachtet, bei denen CpG-Inseln nicht annotiert wurden – Zwei-Nukleotid-Stellen in der DNA, an denen eine natürliche Methylierung in der Zelle stattfindet, dh sie kann potenziell für jede Sequenz im Genom verwendet werden.
Biologen haben auch bestätigt, dass die CRISPRoff-Methylierung rückgängig gemacht werden kann. Dazu haben sie ein ähnliches Tool entwickelt - CRISPRon. Auch dieses Protein bestand aus inaktiviertem Cas und einem Enzym, diesmal jedoch als Demethylierungsmittel. Um seine Arbeit zu testen, verwendeten Biologen Zellen, in denen das CLTA-Gen bereits methyliert war. Innerhalb von zehn Tagen nach der Anwendung von CRISPRon wurde das normale Niveau des Gens in den Zellen wiederhergestellt (p < 0,0001).
Um zu testen, wie die Wirkung von CRISPRoff während der Differenzierung von induzierten Stammzellen (ISCs) in andere Zelltypen anhält, behandelten Biologen diese mit einem Protein und programmierten sie dann in Neuronen um. Dies ist eine der gebräuchlichsten Methoden, um Nervenzellen für die Forschung zu gewinnen, und die Beibehaltung der Methylierung während der Differenzierung ist eine wichtige Eigenschaft für den Einsatz des Instruments. Es stellte sich heraus, dass Neuronen tatsächlich Methylmarkierungen auf den von Wissenschaftlern ausgewählten Genen behielten.
Auch andere Systeme werden auf Basis der CRISPR/Cas-Technologie entwickelt. So wurde beispielsweise kürzlich die Effektivität der Methode mittels Photoinduktion gesteigert und zudem ein Werkzeug geschaffen, das mehrere Gene gleichzeitig bearbeiten und Bereiche daraus herausschneiden kann.
