Ein neuer Test auf SARS-CoV-2 auf Basis des CRISPR/Cas-Systems verspricht ein zuverlässiges Ergebnis in nur fünf Minuten. Gleichzeitig bestimmt er sogar Dutzende von Kopien viraler RNA in einem Mikroliter der Probe und gibt nicht nur eine quantitative, sondern auch eine qualitative Antwort. Um dieses Ergebnis zu erreichen, verwendeten die Wissenschaftler statt einer einen Satz mehrerer Leit-RNAs und adaptierten eine Smartphone-Kamera als Signaldetektor. Die Ergebnisse der Arbeit wurden zuvor auf dem medRxiv-Portal für ungeprüfte Manuskripte veröffentlicht.
Obwohl die ersten Tests auf SARS-CoV-2 erst wenige Wochen nach Ausbruch der Epidemie erschienen, ist es noch immer schwierig, Infizierte rechtzeitig zu identifizieren. Das Problem ist, dass die Tests massiv und schnell sein müssen, da einige der Menschen, die infektiös sein können, keine Symptome haben oder diese erst nach einigen Tagen entwickeln (wir haben darüber im Text "Invisible Corona" geschrieben) und die Die Konzentration des Virus im Speichel unterscheidet sich oft nicht mehr von der von Patienten mit COVID-19.
Die gängigste Methode, ein Virus in einem Sputum-Abstrich einzufangen, ist die Real-Time-PCR (Polymerase-Kettenreaktion) (lesen Sie darüber im Material "The Corona in a Haystack"). Das Funktionsprinzip besteht darin, dass eine Reihe von Enzymen jedes Molekül der viralen RNA kopiert und mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert - und dies geschieht, bis das Lichtsignal stark genug wird, um vom Gerät erkannt zu werden.
Die PCR-Methode ist vor allem aufgrund ihrer Empfindlichkeit beliebt - sie ermöglicht es Ihnen, eine einzelne Kopie der RNA in einem Mikroliter der Probe zu "sehen". Aber es hat seine Nachteile: Der Test dauert von mehreren zehn Minuten bis zu mehreren Stunden, was unter Berücksichtigung der logistischen Schwierigkeiten zu mindestens einem Tag Wartezeit auf das Ergebnis wird, während der der asymptomatische Träger Zeit hat, die Infektion zu verbreiten des Weiteren.
Daher ist der Wunsch nach schnelleren Tests entstanden, die nicht so empfindlich sein müssen: Laut klinischen Studien ist bei einer RNA-Konzentration unter tausend Kopien pro Mikroliter die Anzahl der Viruspartikel in einem Abstrich nicht mehr so signifikant und nicht mehr so groß keine große Gefahr darstellen. Eine alternative Methode, die das Testen beschleunigen könnte, ist das CRISPR/Cas-System (für das kürzlich der Nobelpreis für Chemie verliehen wurde).
Für die Suche nach SARS-CoV-2 wurde dieses System bereits im Frühjahr angepasst und funktionierte so: Aus dem Abstrich eines Patienten wird schnell RNA extrahiert und mehrfach komplett kopiert. Fügen Sie dann Guide-RNA hinzu, die zu den Sequenzen des Virus komplementär ist. Diese RNA bindet an das virale Genom und aktiviert ein Enzym der Cas-Gruppe, das beginnt, die virale RNA zu zerschneiden – und zwar zusammen mit allen einzelsträngigen RNA-Molekülen, denen sie begegnet. Fügt man der Lösung ein an den Farbstoff gebundenes RNA-Molekül hinzu, wird es bei der Spaltung freigesetzt und gibt ein Farbsignal, dass in der Probe ein Virus nachgewiesen wurde.
Dieser gesamte Vorgang dauerte etwa eine Stunde – was bereits schneller ist als die Echtzeit-PCR, aber immer noch nicht schnell genug für Massentests und vor allem erfordert es hoch entwickelte Geräte und Reagenzien. Daher begann eine Gruppe von Wissenschaftlern der University of California unter der Leitung von Nobelpreisträgerin Jennifer Doudna (Jennifer Doudna) mit der Entwicklung eines noch schnelleren und einfacheren Tests für SARS-CoV-2.
Die Forscher erstellten ein Dutzend Leit-RNAs (sie waren alle komplementär zu verschiedenen Teilen des viralen Genoms) und wählten daraus das effizienteste Paar aus. Das System, in dem sich zwei Leit-RNAs befanden, ermöglichte es, mehrere Probleme sofort zu lösen.
So funktioniert der CRISPR/Cas-Test mit zwei RNA-Guides
Erstens beginnt jede Kopie der viralen RNA die Arbeit nicht eines Cas13a-Enzyms, sondern mehrerer gleichzeitig. Und das wiederum macht es möglich, auf das vorherige Kopieren aller RNA in der Probe zu verzichten - das Signal ist bereits stark genug. In der Vollversion dauert der neue Test eine halbe Stunde, aber nach den ersten fünf Minuten Beobachtung konnten die Wissenschaftler eindeutig feststellen, welche Proben positiv und welche negativ sind.
Zweitens arbeitet das Testsystem jetzt noch genauer und reagiert nicht auf die RNA anderer Viren: Die Forscher testeten es an mehreren verwandten SARS-CoV-2-Coronaviren (einschließlich MERS) und erhielten kein Signal. Gleichzeitig blieb die Sensitivität akzeptabel - etwa hundert virale RNAs pro Mikroliter. Als Wissenschaftler versuchten, dem System eine dritte Leit-RNA hinzuzufügen, stellte sich heraus, dass die Empfindlichkeit noch höher war - bis zu 31 Kopien pro Mikroliter.
Drittens können Sie jetzt mit dem Test nicht nur das Vorhandensein, sondern auch die Menge an viraler RNA beurteilen. Da das Stadium der RNA-Kopie aus dem Verfahren verschwunden ist, ändert sich die Anzahl der RNA-Kopien in der Probe nicht und kann anhand der Signalintensität beurteilt werden. Die Forscher glauben, dass eine solche Technologie helfen könnte, das Fortschreiten der Krankheit bei einzelnen Patienten zu verfolgen.
Als Detektor nutzten die Wissenschaftler schließlich eine Smartphone-Kamera, auf deren Grundlage sie ein Laser-Fluoreszenz-Mikroskop konstruierten, das eine Laserstrahlquelle und einen Filter hinzufügte. Es stellte sich heraus, dass die Empfindlichkeit der Kamera ausreicht, um auf sperrige Instrumente zu verzichten und Signale unterschiedlicher Intensität von der Probe zu unterscheiden.
So funktioniert ein Smartphone-Mikroskop
Das neue System funktioniert bisher nur unter Laborbedingungen, aber Jennifer Dudna sagte dem Magazin Science, dass ihre Kollegen nach einer Möglichkeit suchen, ihre Erfindung auf den Markt zu bringen. Sie glauben, dass ihre Methode noch lange relevant bleiben wird: Selbst wenn in den kommenden Monaten ein Impfstoff gegen das Coronavirus auftaucht, ist eine langfristige Immunantwort nicht garantiert, sodass ein Bedarf bestehen bleibt für Massentests zur Verfolgung lokaler Infektionsausbrüche. …
Alle Materialien zur COVID-19-Pandemie veröffentlichen wir in der Rubrik Coronavirus-Chronik. Dort lesen Sie, warum bereits Erkrankte getestet werden und wie ein anderer Express-Test (der zwar die Konzentration von Antikörpern gegen das Virus misst) auf Basis eines Graphen-Sensors funktioniert.
