Erythrozyten eines Patienten mit Thalassämie
Chinesische Forscher haben erfolgreich eine Mutation im Beta-Globin-Gen menschlicher Embryonen korrigiert, die zur Entwicklung einer Anämie führt. Als Werkzeug zur Bearbeitung des Genoms verwendeten die Wissenschaftler einen auf Basis des CRISPR/Cas9-Systems entwickelten „Base Editor“. Mit ihrer Hilfe konnte in einem Viertel der Fälle gezielt eine einzelne Nukleotidsubstitution in das Genom eingeführt werden. Die Studie wurde in der Zeitschrift Protein & Cell veröffentlicht und wird auch in einem Editorial in Nature vorgestellt.
Mutationen in den Hämoglobinketten codierenden Genen sind die Ursache für die Entwicklung von Thalassämie - Anämie, die durch eine Verletzung der Hämoglobinsynthese verursacht wird. Die Substitution von Guanin durch Adenin durch einzelne Nukleotide in der regulatorischen Region des HBB-Gens (HBB –28 A> G), das für Beta-Globin kodiert, ist eine der drei häufigsten Ursachen für Beta-Thalassämie in China und Südostasien. Diese Mutation führt zu einer Abnahme der Expression des HBB-Gens und in der Folge zu einem Hämoglobinmangel in seinem Träger.
Chinesischen Forschern der Sun Yat-sen University ist es gelungen, diese Mutation in menschlichen Embryonen zu korrigieren, indem sie G mit einem neuen CRISPR / Cas9-basierten Genom-Editing-Tool wieder in A umwandeln. Die Bearbeitungseffizienz betrug 40 Prozent auf Embryoebene und 23 Prozent auf Einzelzellebene.
Das neue System mit dem Namen "Base Editor" (eine Publikation zur Entwicklung dieser Methode finden Sie hier) verwendet ein katalytisch inaktives Protein dCas9, das DNA nicht schneiden kann. Ein solches Protein dient in Kombination mit einer Leit-RNA als Mittel, um die daran angeheftete "Arbeits"-Domäne an eine spezifische DNA-Sequenz zu übertragen.
Der Arbeitsteil im „Editor“ist das Enzym Cytosin-Deaminase, das die Aminogruppe von Cytosin „abreißt“und an seiner Stelle Uracil zurücklässt. Dadurch entsteht in der DNA ein „falsches“U:G-Paar (Uracil versus Guanin), das vom ungepaarten Basenreparatursystem erkannt wird. Durch eine weitere Modifikation der Methode konnte erreicht werden, dass G in der Kette repariert wird, was zur Bildung des "richtigen" U: A-Paares führt, das nach einer Replikationsrunde zu T: A wird. Das Schema der Methode ist unten dargestellt, und Sie können das Prinzip des ursprünglichen Cas9-Proteins hier auffrischen.
So funktioniert der "Radix-Editor". Inaktives Cas9 (dCas9) ist blau markiert, Cytosindeaminase ist rot und Guide-RNA ist grün dargestellt. Nachdem das Fusionsprotein an die gewünschte DNA-Region bindet, wandelt Cytosin-Deaminase Cytosin in Uracil um, wodurch nach Reparatur und einer Replikationsrunde das G:C-Paar durch A: T. ersetzt wird
Zuvor zeigte eine andere Forschungsgruppe, dass diese Methode bei dreikernigen Zygoten („defekte“Embryonen, die durch künstliche Befruchtung erhalten wurden und einen dreifachen Chromosomensatz enthalten) anwendbar ist. In der neuen Arbeit benötigten die Forscher Embryonen, die die Mutation HBB −28 (A> G) in zwei Kopien enthielten. Solche Embryonen wurden durch Klonen gewonnen - die Fusion der Körperzelle eines Patienten mit Thalassämie mit einem nicht-nuklearen Ei.
In die entstandenen einzelligen Embryonen injizierten die Forscher kurz nach der Fusion die mRNA des "Editors" und die Leit-RNA dafür. Nach 48 Stunden, nachdem die sich entwickelnden Embryonen Zeit hatten, drei bis vier Teilungen zu durchlaufen, analysierten die Autoren, ob die Bearbeitung bestanden war. Die Analyse wurde durchgeführt, indem die Stelle mit der zu korrigierenden Mutation und zehn zusätzliche Stellen sequenziert wurden, an denen der "Herausgeber" potentiell angezogen werden könnte.
Im ersten Experiment zeigte die Analyse der Gesamt-DNA von 22 Embryonen, dass in 9 Fällen die Bearbeitung korrekt war und G durch A ersetzt wurde. In einem anderen wurde G durch C ersetzt. Somit wurden 40 Prozent der Embryonen erfolgreich bearbeitet.
Im zweiten Experiment wurde die Editiereffizienz auf der Ebene einzelner embryonaler Zellen bewertet. In diesem Fall betrug die Erfolgsrate 11 von 48, während in acht Fällen die Bearbeitung durch beide Stränge ging, dh beide Kopien des HBB-Gens wurden korrigiert. Eine solche Diskrepanz zwischen den Ergebnissen auf der Ebene einzelner Zellen und auf Ebene der Embryonen weist jedoch direkt darauf hin, dass sich alle untersuchten Embryonen als "Mosaiken" erwiesen haben. Dies bedeutet, dass nach der Bearbeitung in verschiedenen Zellen desselben Embryos der Genotyp unterschiedlich ist. Heute ist der Embryomosaikismus eines der wichtigsten und ungelösten Probleme der menschlichen Bearbeitung.
Dieselbe Forschungsgruppe hat vor zwei Jahren eine bahnbrechende Arbeit zur Bearbeitung des Genoms menschlicher Embryonen veröffentlicht, die Sie hier lesen können. In früheren Arbeiten versuchten Wissenschaftler, eine Mutation im HBB-Gen mithilfe des „kanonischen“CRISPR/Cas9-Systems durch homologe Rekombination zu korrigieren, um eine Substitution in der DNA vorzunehmen. Die Editiereffizienz erwies sich jedoch als sehr gering – sie fand nur in vier Fällen bei 54 untersuchten Embryonen statt.
