Escherichia coli-Deaminase TadA, die im Experiment verwendet wurde
Genetiker haben ein Genom-Editing-Tool entwickelt, das nicht beide Stränge eines DNA-Moleküls schneiden muss und Mutationen "zurückrollen" kann, indem sie A-T-Nukleotidpaare in G-C-Paare umwandeln. Zuvor konnten solche Editoren nur G-C- in A-T-Paare umwandeln, dh sie deckten nur die Hälfte der Mutationsvarianten ab. Die Arbeit wurde in der Zeitschrift Nature veröffentlicht.
Etwa die Hälfte der krankheitsverursachenden Mutationen in der menschlichen DNA ist mit einer spontanen Trennung der Aminogruppe (Deaminierung) vom Cytosin (C)-Nukleotid verbunden, was zum Ersatz von C-G-Paaren durch T-A-Paare führt. Die Desaminierung von Adenin führt wiederum zum Auftreten von Inosin, das von Polymerasen als Guanin wahrgenommen wird, und diese Reaktion könnte ein Weg sein, die Umwandlung von C-G in T-A "zurückzurollen". Bisher gab es jedoch keine Enzyme, die Adenine in DNA erfolgreich desaminieren können. Wissenschaftler konnten Adenin-Basen-Editoren (ABEs) entwickeln, indem sie sie auf der Grundlage von tRNA-Adenin-Deaminasen erstellten, die an ein modifiziertes CRISPR-Cas9-System "vernäht" wurden. In diesem Fall ist das System notwendig, um die richtige DNA-Sequenz zu finden (mehr zu CRISPR-bezogenen Genom-Editing-Methoden lesen Sie in unserem Material).
Die gängigsten Basiseditoren sind in der Lage, C-G-Paare in T-A-Paare umzuwandeln. Sie bestehen aus mehreren Komponenten: einem modifizierten CRISPR-Cas9-System, das keine doppelsträngigen Schnitte in der DNA vornehmen kann, aber in der Lage ist, den gewünschten Teil davon zu finden; Cytidyldeaminase, die Cytosin durch Uracil im Fünf-Nukleotid-Fenster einer einzelsträngigen "Blase" ersetzen kann, die das Cas9-Protein auf der DNA erzeugt; und ein Inhibitor der Uracil-Glykosylase, der die Entfernung von Uracil und eine Reihe anderer Prozesse stört, die die Reinheit des Editierprodukts beeinträchtigen. Die Nickase-Aktivität des Systems ermöglicht es auch, einen einzelsträngigen Schnitt am "gegenüber" nicht bearbeitbaren DNA-Strang vorzunehmen, um die Arbeit des DNA-Reparatursystems zu aktivieren, das dort Guanin durch Adenin ersetzt. Solche Editoren arbeiten erfolgreich in den Genomen von Mäusen, Pflanzen, Hefen, Fischen und sogar menschlichen Embryonen. Sie benötigen keine DNA-Vorlagen, um zu funktionieren. Sie können hier mehr darüber lesen.
Um einen ähnlichen Editor zu erstellen, aber AT in GC-Paare umzuwandeln, wählten Wissenschaftler von Harvard und MIT eine Reihe bekannter Adenin-Deaminasen von E. coli, Mensch und Maus aus, die erfolgreich freie Adenine, Adenosine, Adenosine in RNA und Adenosine in gepaarte RNAs -DNA-Heteroduplexe. Sie wurden unter Verwendung von Plasmiden in Bakterienzellen eingeführt und ihre Aktivität untersucht. Es stellte sich heraus, dass keines der Enzyme in seiner ursprünglichen Form Adenosine in doppelsträngiger DNA effektiv desaminieren konnte.
Wissenschaftler haben Methoden des Protein-Engineering und der gerichteten Evolution verwendet, die die natürliche Selektion unter streng definierten Bedingungen nachahmen. Sie arbeiteten mit Bakterien, die Mutationen im Antibiotikaresistenzgen aufweisen. Sie wurden mit Antibiotika behandelt und es traten Resistenzen bei Bakterien auf, bei denen die Genom-Editierung (Reparatur von Resistenzgenen) erfolgreich war. Die besten Ergebnisse zeigte die tRNA-Deaminase TadA. Um die Effizienz des Enzyms zu steigern, wurden einige seiner Modifikationen durchgeführt, insbesondere zeigte die Selektionsphase, dass es für eine erfolgreiche Arbeit mit DNA eine Mutation an der D108-Position im entsprechenden Gen benötigt, und eine solche Mutation wurde in es. Außerdem stellte sich ua heraus, dass die Effizienz des Enzyms bei seiner Dimerisierung zunimmt.
Schema der gerichteten Evolution zur Gewinnung effizienter genomischer Editoren und deren Einführung in Säugerzellen
Als Ergebnis erhielten die Wissenschaftler in der siebten Generation effiziente Editoren (ABE7.10), die die erforderlichen A-T-Paare durch G-C-Paare mit einer Effizienz von bis zu 50 Prozent ersetzten. In diesem Fall betrug der Anteil der seitlichen Insertionen und Deletionen im Durchschnitt nicht mehr als 0,1 Prozent. Die gängigeren genomischen Editierverfahren auf Basis von CRISPR-Cas9-Systemen beinhalten die Einführung von Doppelbrüchen in DNA-Stränge, und dieser Prozess erzeugt in der Regel viel mehr seitliche Insertionen und Deletionen. Darüber hinaus erwies sich die Bearbeitung mit ABEs als genauer, da weniger Ersetzungen außerhalb des Ziels erzeugt wurden.
Das Arbeitsschema des ABE-Redakteurs
Wissenschaftler führten separat ein Experiment durch, das die Wirksamkeit von ABE bei der Bearbeitung von krankheitsverursachenden Mutationen demonstrierte. Es ist bekannt, dass Mutationen im Beta-Globin-Gen eine Vielzahl von Bluterkrankungen verursachen. Einige ihrer Träger sind jedoch aufgrund von Mutationen in den Promotorregionen der Gamma-Globin-Gene resistent gegen sie. Wissenschaftler haben einen speziellen ABE-Editor entwickelt, der Mutationen in diesen Bereichen einführt und AT durch G-C ersetzt. Es zeigte 29% und 30% Effizienz auf zwei Promotoren in HEK293T-Zellen.
Ein ähnliches Experiment wurde mit dem HFE-Gen durchgeführt, einer Mutation, die beim Menschen Hämochromatose verursacht. Das Enzym funktionierte in 28 Prozent der Fälle erfolgreich, ersetzte das 845. Nukleotid im Gen und änderte dementsprechend die Aminosäure des entsprechenden Strahls von Tyrosin zu Cystein.
Wissenschaftler stellen fest, dass die Umwandlung von Cytosin in Thymin oder Uracil in jeder menschlichen Zelle 100- bis 500-mal am Tag stattfindet. Dieser Prozess kann zu Mutationen in wichtigen Bereichen der DNA führen und zu einer Vielzahl von genetischen Erkrankungen führen. Genomische Editoren in die Lage zu versetzen, die ursprüngliche DNA-Sequenz sowohl bei AT- als auch bei G-C-Paaren zu rekonstruieren, ist ein wichtiger Schritt für gentechnische Methoden.
Erfahren Sie hier mehr über die ersten Experimente mit menschlichen Embryonen und Editoren, die C-G-Paare in T-A-Paare umwandeln.
